近日,?天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院在cell?reports雜志在線發(fā)表了研究論文”Single-cell?and?spatial?transcriptomics?reveal?the?pathogenesis?of?chronic?granulomatous?disease?in?a?natural?model”。

研究背景

慢性肉芽腫病（Chronic?Granulomatous?Disease,?CGD）是一種由NADPH氧化酶2（NOX2）復(fù)合體功能缺失突變引起的原發(fā)性免疫缺陷病。這種缺陷會導(dǎo)致產(chǎn)生ROS的多種先天免疫細(xì)胞受到損害，機(jī)體抵御微生物的能力下降，導(dǎo)致CGD患者易發(fā)生反復(fù)感染和過度炎癥反應(yīng)。本研究通過構(gòu)建自然CGD小鼠模型，結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（scRNA-seq）和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（包括BMKMANU?S1000平臺），深入解析了CGD肺部肉芽腫形成的細(xì)胞與分子機(jī)制，從CGD肺肉芽腫組織中鑒定出具有NOS2高表達(dá)特征的中性粒細(xì)胞和MMP12+巨噬細(xì)胞，并提出MIF和Morbidity為CGD治療的潛在靶點(diǎn)。

研究內(nèi)容及結(jié)果

1、通過接觸清潔環(huán)境（CL）建立CGD肉芽腫模型

通過不同環(huán)境暴露（SPF或CL）實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)研究了環(huán)境病原體對CGD遺傳背景小鼠表型的影響。表現(xiàn)為HE染色全肺葉顯微圖像可見CL環(huán)境下的Ncf2?/?小鼠肺部出現(xiàn)明顯的肉芽腫結(jié)構(gòu)，伴隨炎癥細(xì)胞浸潤和組織壞死，其他組小鼠肺部正常。免疫熒光顯示肉芽腫中的巨噬細(xì)胞（CD68+）表達(dá)上皮標(biāo)志物E-cadherin，提示巨噬細(xì)胞發(fā)生上皮樣轉(zhuǎn)化。通過ELISA法檢測CL?Ncf2?/?小鼠血清中的IL-1β和IFN-γ炎癥相關(guān)蛋白水平較CL?WT組增加。16S?rRNA/ITS?測序顯示CL?Ncf2?/?小鼠肺部細(xì)菌（如克雷伯菌和葡萄球菌）和真菌（如Talaromyces）負(fù)荷顯著增加。

2、單細(xì)胞分辨率下小鼠肺部免疫景觀的分析

通過單細(xì)胞RNA測序和流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)CGD小鼠肺部炎癥微環(huán)境以髓系細(xì)胞浸潤為主，提示其參與肉芽腫形成。其中單細(xì)胞測序，最終保留了25296個高質(zhì)量細(xì)胞樣本，每個細(xì)胞平均包含6466條比對讀數(shù)和1972個基因，并識別出9種免疫細(xì)胞類型及九種基質(zhì)細(xì)胞類型。還發(fā)現(xiàn)一個以細(xì)胞周期相關(guān)基因（Mki67和Top2a）高表達(dá)為特征的細(xì)胞簇。通過流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，CL?Ncf2?/?小鼠中CD11b高表達(dá)的F4/80+MDMs在比例和絕對數(shù)量上均顯著增加，這些結(jié)果揭示了慢性肉芽腫性葡萄膜炎（CGD）小鼠在肺部感染過程中免疫細(xì)胞組成的顯著變化，尤其是中性粒細(xì)胞和MDMs的明顯聚集現(xiàn)象。

3、CGD小鼠中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄改變

研究顯示，中性粒細(xì)胞分為6個亞群，其中Neu6亞群在CL?Ncf2?/?小鼠中顯著擴(kuò)增且Neu6高表達(dá)促炎基因（如Nos2、Mif、Tnf、Il1b）。NO是一種在病原體清除過程中起關(guān)鍵作用由NOS2合成的可擴(kuò)散小分子，CL?Ncf2?/?小鼠肺部的總NO生成量顯著升高。流式驗(yàn)證顯示CL?Ncf2?/?小鼠肺中NOS2high中性粒細(xì)胞比例顯著增加。這些結(jié)果均提示NOS2high中性粒細(xì)胞通過產(chǎn)生一氧化氮（NO）和促炎因子，驅(qū)動肉芽腫核心區(qū)的炎癥反應(yīng)。

4、CGD小鼠單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞區(qū)室的轉(zhuǎn)錄改變

通過對巨噬細(xì)胞亞群進(jìn)行聚類分析和功能富集，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞分為5個亞群，Mac1亞群在CL?Ncf2?/?小鼠中顯著增加。Mac1同時表達(dá)M1（Nos2）和M2（Arg1）標(biāo)志物，以及促纖維化基因（如Mmp12、Spp1）。免疫熒光顯示MMP12+巨噬細(xì)胞特異性分布于肉芽腫外圍。以上結(jié)果提示MMP12+巨噬細(xì)胞具有混合表型，可能通過細(xì)胞外基質(zhì)重塑促進(jìn)肉芽腫的纖維化包裹。

5、空間轉(zhuǎn)錄組揭示肉芽腫結(jié)構(gòu)

使用SeekSpace和BMKMANU?S1000平臺分析肺組織切片的空間轉(zhuǎn)錄組。研究表明肉芽腫核心區(qū)富集中性粒細(xì)胞（Neu6亞群），外圍富集巨噬細(xì)胞（Mac1亞群）和成纖維細(xì)胞。Mac1高表達(dá)促炎（Nos2）和促纖維化（Mmp12、Fn1）基因。成纖維細(xì)胞高表達(dá)膠原基因（Col1a1、Col4a1），提示其參與纖維化。

以上結(jié)果提示通過BMKMANU?S1000平臺進(jìn)行的空間轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)Neu6占據(jù)肉芽腫中心區(qū)域，而Mac1和成纖維細(xì)胞在外圍區(qū)域參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑和纖維化包被過程。明確了肉芽腫中不同細(xì)胞的分布和功能分工，揭示了炎癥與纖維化的協(xié)同作用。

6、干預(yù)策略的效果驗(yàn)證

通過對巨噬細(xì)胞亞群進(jìn)行聚類分析和功能富集，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞分為5個亞群，Mac1亞群在CL?Ncf2?/?小鼠中顯著增加。Mac1同時表達(dá)M1（Nos2）和M2（Arg1）標(biāo)志物，以及促纖維化基因（如Mmp12、Spp1）。免疫熒光顯示MMP12+巨噬細(xì)胞特異性分布于肉芽腫外圍。以上結(jié)果提示MMP12+巨噬細(xì)胞具有混合表型，可能通過細(xì)胞外基質(zhì)重塑促進(jìn)肉芽腫的纖維化包裹。

研究總結(jié)

首次通過環(huán)境暴露構(gòu)建自然CGD模型，結(jié)合多組學(xué)技術(shù)解析肉芽腫的細(xì)胞和分子機(jī)制。本研究揭示了CGD肉芽腫中NOS2high中性粒細(xì)胞和MMP12+巨噬細(xì)胞的協(xié)同作用，并提出MIF和Morrbid作為潛在治療靶點(diǎn)，為CGD的精準(zhǔn)干預(yù)提供了理論基礎(chǔ)。BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組通過高分辨率空間定位明確揭示了中性粒細(xì)胞（Neu6亞群）在肉芽腫核心、巨噬細(xì)胞（Mac1亞群）和成纖維細(xì)胞在外圍的分布。在基因表達(dá)驗(yàn)證時確認(rèn)了NOS2、MIF、IL-1β等基因在肉芽腫不同區(qū)域的差異表達(dá)，這一結(jié)果與scRNA-seq結(jié)果高度一致，展示了BMKMANU?S1000在疾病微環(huán)境研究中的高效性。