■ 基本信息
啟動(dòng)子: | araBAD |
復(fù)制子: | pSC101 |
終止子: | λ tL3 terminator |
原核抗性: | Amp |
克隆菌株: | DH5a |
培養(yǎng)條件: | 30度 |
表達(dá)宿主: | 大腸桿菌 |
誘導(dǎo)方式: | 阿拉伯糖 |
■ 質(zhì)粒屬性
質(zhì)粒宿主: | 大腸桿菌 |
質(zhì)粒用途: | 基因編輯 |
片段類型: | ORF
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片段物種: |
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原核抗性: | Amp |
真核抗性: |
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熒光標(biāo)記: |
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■ 質(zhì)粒簡(jiǎn)介
pKD46質(zhì)粒是目前應(yīng)用最廣泛的Red同源重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有受阿拉伯糖啟動(dòng)子調(diào)控的exo、bet、gam基因，其復(fù)制子為低拷貝溫敏型復(fù)制子，便于質(zhì)粒的消除。
與同源重組基因敲除相關(guān)的3個(gè)酶：
1、Exo蛋白：Exo蛋白是一種核酸外切酶，單亞基的分子量為24 kD，Exo蛋白的活性形式是一種環(huán)狀三聚物分子，中間有一中空的通道，通道的一端可容納雙鏈DNA分子，另一端只可容納單鏈DNA。Exo蛋白可結(jié)合在雙鏈DNA的末端，從DNA雙鏈的5’端向3’端降解DNA，使DNA分子形成3’粘性末端。
2、Beta蛋白：Beta蛋白在Red同源重組中起著決定性作用，具有介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA退火的功能，是一種退火蛋白，單亞基的分子量為25.8 kD。在溶液中，Beta蛋白自發(fā)地形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，緊緊地結(jié)合在單鏈DNA的3’突出端，防止DNA被單鏈核酸酶降解，并介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA的退火。雙鏈DNA退火完成后，Beta蛋白從DNA雙鏈上解離下來(lái)。
3、Gam蛋白：Gam蛋白為16kD的多肽分子，可與RecBCD核酸外切酶結(jié)合，抑制其對(duì)外源DNA的降解作用，防止外源DNA 進(jìn)入細(xì)胞后被宿主降解。
參考文獻(xiàn)：
[1] Datsenko KA1, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA. 2000,97(12):6640-6645.
[2] Doublet B, Douard G, Targant H, et al. Antibiotic marker modifications of lambda Red and FLP helper plasmids, pKD46 and pCP20, for inactivation of chromosomal genes using PCR products in multidrug-resistant strains. J Microbiol Methods. 2008,75(2):359-361. Doi: 10.1016/j.mimet.2008.06.010
■ 功能簡(jiǎn)介
主要用于原核生物的基因敲除Red同源重組的協(xié)助質(zhì)粒溫度敏感復(fù)制子高于37℃該質(zhì)粒會(huì)丟失阿拉伯糖誘導(dǎo)后表Gam、Bet和Exo三個(gè)λ噬菌體重組酶氨芐青霉素抗性。
■ 質(zhì)粒圖譜
■ 質(zhì)粒序列
質(zhì)粒序列請(qǐng)下載：
ZK1659 pKD46大腸敲除質(zhì)粒.txt
